Im Blatt läuft die Fotosynthese vor allem im Palisaden- und Schwammgewebe. Die untere Epidermis trägt die Spaltöffnungen für den Gasaustausch. Die Zellen enthalten viele Chloroplasten mit zwei Hüllmembranen:

Sichtbares Licht hat Wellenlängen von etwa 400 bis 700 Nanometern (nm). Ein Farbstoff absorbiert (verschluckt) nur bestimmte Wellenlängen. Das Absorptionsspektrum zeigt, wie viel Licht er bei jeder Wellenlänge absorbiert. Chlorophyll a absorbiert am stärksten im blauvioletten (etwa 430 nm) und im roten Bereich (etwa 660 nm), Chlorophyll b etwa bei 450 nm und 640 nm. Grünes Licht wird kaum absorbiert und zurückgeworfen, darum sieht das Blatt grün aus.

Das Wirkungsspektrum zeigt die Fotosyntheserate (zum Beispiel die O$_2$-Abgabe) je Wellenlänge. Es folgt dem Absorptionsspektrum, liegt aber im blaugrünen Bereich höher als das von Chlorophyll a, weil Chlorophyll b und Carotinoide dort Licht absorbieren und die Energie weitergeben.

Die Chromatografie trennt ein Farbstoffgemisch. Man trägt den Blattextrakt als Strich auf Chromatografiepapier auf und stellt es in ein Laufmittel (zum Beispiel Petroleumether und Aceton). Es steigt auf und nimmt die Farbstoffe verschieden weit mit: Je besser sich ein Farbstoff löst und je schwächer er am Papier haftet, desto weiter wandert er. Von oben nach unten findet man Carotin (gelborange), Xanthophylle (gelb), Chlorophyll a (blaugrün) und Chlorophyll b (gelbgrün). Der Rf-Wert kennzeichnet jeden Farbstoff:

Sie laufen in der Thylakoidmembran ab, wo Fotosystem II (ein Proteinkomplex mit Chlorophyll), eine Elektronentransportkette, Fotosystem I und die ATP-Synthase sitzen:

Schritt 1: Licht regt das Chlorophyll in Fotosystem II an, es gibt Elektronen ab.
Schritt 2: Die Photolyse ersetzt sie: Wasser wird im Thylakoidinnenraum gespalten, $2\,\mathrm{H_2O} \to \mathrm{O_2} + 4\,\mathrm{H^+} + 4\,e^-$. Der Sauerstoff der Fotosynthese stammt aus Wasser.
Schritt 3: Die Elektronen laufen durch die Transportkette zu Fotosystem I. Die Kette pumpt dabei Protonen aus dem Stroma in den Thylakoidinnenraum.
Schritt 4: Fotosystem I wird durch Licht angeregt. Seine Elektronen reduzieren NADP$^+$ zu NADPH.
Schritt 5: Die Protonen strömen durch die ATP-Synthase ins Stroma zurück und bilden ATP aus ADP und P$_i$. Die Lichtenergie steckt nun in ATP und NADPH.

Ein Lichtsammelkomplex besteht aus einigen Hundert Pigmentmolekülen (Chlorophyll a und b, Carotinoide) um ein Reaktionszentrum. Sie fangen Licht breit ein und leiten die Anregungsenergie zum Reaktionszentrum, einem Chlorophyll-a-Paar (P680 in Fotosystem II, P700 in Fotosystem I). Erst dort wird ein Elektron abgegeben.

Das energetische Modell (Z-Schema) trägt die Energieniveaus der Elektronen als Redoxpotenziale auf. Wasser (+0,82 V) gibt Elektronen auf tiefem Niveau ab. Licht hebt sie in Fotosystem II hoch, sie fallen durch die Transportkette abwärts und treiben die Protonenpumpe an. Fotosystem I hebt sie ein zweites Mal, bis sie NADP$^+$ (−0,32 V) reduzieren. Der Weg hat die Form eines Z. Ein Elektronenpaar wird insgesamt um 1,14 V angehoben:

Im Stroma bindet der Calvin-Zyklus CO$_2$ und baut mit ATP und NADPH Zucker auf. Er hat drei Phasen:

Schritt 1, Fixierung: Das Enzym Rubisco verbindet CO$_2$ mit Ribulose-1,5-bisphosphat (RuBP, 5 C-Atome). Das Produkt zerfällt in zwei Moleküle 3-Phosphoglycerat (3 C-Atome).
Schritt 2, Reduktion: Mit ATP und NADPH wird 3-Phosphoglycerat zu Glycerinaldehyd-3-phosphat (G3P, 3 C-Atome) reduziert. G3P ist ein Zucker, Ausgangsstoff für Glucose und Stärke.
Schritt 3, Regeneration: Von je sechs gebildeten G3P verlässt eines den Zyklus. Die übrigen fünf werden mit ATP wieder zu RuBP umgebaut.

Die Fotosyntheserate misst man als O$_2$-Abgabe oder CO$_2$-Aufnahme je Zeit und Blattfläche. Gemessen wird die Nettorate, denn die Zellatmung verbraucht gleichzeitig O$_2$ und setzt CO$_2$ frei: Nettorate = Bruttorate minus Atmung. Der Lichtkompensationspunkt ist die Lichtstärke, bei der Fotosynthese und Atmung gleich groß sind und die Nettorate null ist.

• Licht und CO$_2$: Die Rate steigt mit beiden, dann folgt eine Sättigung, weil ein anderer Faktor begrenzt.
• Temperatur: Die Enzyme des Calvin-Zyklus haben ein Optimum, bei hoher Temperatur sinkt die Rate.
• Wasser: Bei Trockenheit schließen sich die Spaltöffnungen, und es kommt weniger CO$_2$ ins Blatt.

Der knappste Faktor heißt begrenzender Faktor und bestimmt die Rate.

Rubisco bindet neben CO$_2$ auch O$_2$. Diese Photorespiration verschwendet Energie, vor allem bei Hitze und Trockenheit, wenn die Spaltöffnungen schließen und CO$_2$ im Blatt knapp wird. C3-Pflanzen (Weizen, Reis, Kartoffel) fixieren CO$_2$ nur mit Rubisco. Ihr erstes stabiles Produkt hat 3 C-Atome.

C4-Pflanzen (Mais, Zuckerrohr) trennen die Schritte räumlich. In den Mesophyllzellen bindet die PEP-Carboxylase CO$_2$ an Phosphoenolpyruvat zu Oxalacetat (4 C-Atome), das zu Malat wird. Malat gibt in den Bündelscheidenzellen CO$_2$ wieder ab, sodass Rubisco dort in CO$_2$-reicher Umgebung arbeitet. Der Preis ist ein höherer ATP-Verbrauch, der Vorteil eine hohe Rate bei Hitze, viel Licht und wenig Wasser.

Bei der Tracer-Methode markiert man Stoffe mit Isotopen und verfolgt sie. Ruben und Kamen boten Grünalgen 1941 Wasser oder CO$_2$ mit dem schweren Sauerstoffisotop $^{18}$O an. Nur bei markiertem Wasser enthielt der freigesetzte Sauerstoff das Isotop. Calvin bot Grünalgen radioaktives $^{14}$CO$_2$ an und trennte die Stoffe nach kurzer Zeit durch Chromatografie. Als Erstes war 3-Phosphoglycerat markiert.